Crkva je posvećena Sv. ocu Nikolaju, tj. prenosu moštiju Sv. Nikole, a slava je 22. maja. Na severnoj strani od ove crkve nalazila se prvobitna drvena Crkva, izgrađena verovatno odmah posle Velike Seobe 1692.
Današnju crkvu podigli su trgovci, braća Nedeljko i Stojić Bogdanović 1726-1730. Braća su se doselila u Petrovaradinski Šanac (prvobitni Novi Sad) 1716. iz Slavonije. Po dolasku u Novi Sad, Nedeljko je otišao na hadžluk u Svetu zemlju, zadržao se u Hilandaru i zamonašio. Ostao je u uspomeni, a crkva je dugo nazivana Nedeljkova crkva. Krajem 18. veka crkva je ustupljena pravoslavnim grčkim i ruskim građanima Novog Sada, a nedeljom su se naizmenično održavale grčka i crkvenoslovenska liturgija. Otuda je i uobičajeni naziv – Nikolajevska – po ruskom nazivu. U Buni 1849. sa Tvrđave je bombardovan grad, a crkva je teško oštećena. Crkva je do 1854. bila zapuštena i zarasla u korov, a tada je provizorno pokrivena i služila kao vojni magacin. Crkvu su 1862. obnovili Jovan i Marija Trandafil. Novi (sadašnji) ikonostas je posle obnove 1862. oslikao novosadski akademski slikar, đak Bečke slikarske akademije, Pavle Simić. Natpisi na ikonama su na grčkom, jer se bogosluženje obavljalo i na tom jeziku.
Jovan i Marija Trandafil su sahranjeni u crkvi, a ploče su na unutrašnjem zidu. Pored obnove crkve, darivanja kuće za sveštenički stan i 80 jutara zemlje za izdržavanje crkve i sveštenika, darivali su i drugo gradu. Najpoznatija je sadašnja zgrada Matice Srpske koju je Marija Trandafil izgradila za sirotište a koja je preko puta ulaza u crkvenu portu – sadašnji prolaz ka Trifkovićevom trgu. Barokni toranj je dozidan posle izgradnje crke, a kube, karakterističnog izgleda za ruske crkve, vezuje se za pomoć koja je iz Rusije dobijena 1852. za novosadske crkve stradale u bombardovanju 1849. i kao simbol ruskog prisustva na ovom prostoru. Obnovljeno je nedavno pre nego što sam načinio ove fotografije. Na sevrnom spoljnjem zidu je nadgrobna ploča novosađanina Simeona Radonića, umrlog 1749. godinu dana posle proglašenja Petrovaradinskog šanca za slobodan kraljevski grad, i to je jedna od najranijih ploča u kojoj se pominje Novi Sad kao novo ime grada. Na već nečitkoj ploči, koja je prvobitno bila na tlu pored crkve a sada je pročvršćena uz zid ispod prozora, piše da je tu 1754. sahranjen jedan od ktitora – Stojić Bogdanović.
U Novom Sadu postoji preko 120 verskih objekata i možda su baš oni najbolji pokazatelj viševekovnog zajedničkog življenja različitih naroda na ovom prostoru. Od kraja XVII veka na teritoriji Vojvodine žive pripadnici 26 nacija, a u upotrebi je pet zvaničnih jezika. Iako su zadržana karakteristična obeležja svakog naroda, ipak su se tradicija i običaji neminovno mešali.
U prošlosti u Nikolajevsku crkvu su dolazili kako Srbi, tako i Rusi i Grci, odnosno Cincari. Za vreme Mađarske revolucije 1849. godine, odnosno Bune, kada je bombardovan Novi Sad i crkva je ne samo stradala, nego je i bila potpuno uništena. Zidove crkve su oslikali Dimitrije i Živko Petrović i Nikola Dimšić. Poznato je, da su tadašnji ugledni i imućni novosađani skupili novac, odneli u Beč i „kupili“ slobodu pa je 1. februara 1748. godine carica Habzburške monarhije Marija Terezija potpisala Povelju i proglasila Novi Sad slobodnim kraljevskim gradom. Tada je promenjeno ime Petrovaradinskog Šanca u Novi Sad.
Kakvu ulogu i značaj je crkva imala u životu tadašnjih stanovnika Novog Sada govori i podatak da je jednu od kuća koja je pripadala porodici Marije Trandafil, ova velika novosadska dobrotvorka ostavila na upravljanje Nikolajevskoj crkvi kako bi na taj način bila obezbeđena sredstva za sveštenika, pojca, crkvenjaka i tekuće troškove. To je čuvena kuća sa ikonom u Pašićevoj ulici.
Ova crkva je, takođe, značajna, jer su u njoj sahranjeni i mnogi znameniti Novosađani, kao što je porodica Bogdanovića, koja je ulagala u crkvu. Zatim tu su sahranjeni doborotvori Jovan i Marija Trandafil. Međutim, malo sveta zna da je Nikolajevska crkva poznata i po tome što je tu kršteno dvoje od troje dece Alberta Anštajna i Mileve Marić Ajnštajn. Prvo njihovo dete je bila ćerka o kojoj se ne zna mnogo, a drugo dvoje dece – Edvard i Albert su kršteni ovde, po pravoslavnom obredu, na insistiranje Milevinog oca Miloša Marića .
To je najstarija I najmanja pravoslavna crkva u Novom Sadu u postojećem stanju. Kao takva jeste deo kulturne-istorijske baštine našeg grada – kako materijalne, tako i nematerijalne. Svi narodi koji žive u Vojvodini su obogatili ovaj prostor svojom tradicijom i kulturnom baštnom. S obzirom na to da su uglavnom doseljavani sa ciljem da služe kao vojnici i odbrane granice Habzburške monarhije, dele zajedničku prošlost, a da bi se jedinstvena obeležja svakog naroda sačuvala za budućnost treba ih poznavati, negovati i poštovati.
